광학 현미경 용도: Fluorescence (형광)

저자: Stephan Briggs

Fluorescence microscopy는 흡수, 분산 혹은 반사와 반대로 fluorophore(형광단)를 사용하여 유발되는 형광성을 이용하는 광학 microscopy 기술입니다. Fluorophore는 형광염료의 종류 중 하나로 fluorescence microscopy로 검사하기 위해 단백질이나 조직, 세포들을 형광색으로 라벨링을 하는 데 사용됩니다. Fluorophore는 일반적으로 excitation range(여기 범위)라고 불리는 특정한 파장 영역의 에너지를 흡수하고, 일반적으로 방출 범위라고 불리는 또 다른 특정 파장 영역의 에너지를 재방출함으로써 작동합니다.

Fluorescence microscope system은 epifluorescent 현미경과 같은 매우 단순한 것부터 confocal이나 multiphoton 시스템 같은 매우 복잡한 것까지 다양한 범위를 갖습니다. 간단하든 복잡하든, fluorescence microscope는 다음과 같은 기본 개념을 공유합니다. 샘플을 비추기 위해서는 excitation(여기) 에너지가 사용되며, 방출되는 파장의 에너지 유형이 비록 약할지라도 이를 정량화할 수 있습니다. 여기와 방출 파장은 동일한 중심 파장을 함께 사용하지 않으며, 이는 특정 optical filter를 통해 전반적인 contrast와 신호를 높일 수 있게 해줍니다.

이미지 형상

그림 1은 실제 발광된 샘플을 보여줍니다. 이 샘플은 짧은 파장 광원(350 - 500nm)에 의해 여기되어, 여기 파장(500nm +)보다 더 긴 형광성 파장을 방출합니다. 이 이미지는 좁은 밴드폭의 빛을 센서로 전파하여, 매우 또렷하고 높은 contrast의 이미지를 만들어내는 진보된 광학 필터링 기술이 아니면 캡처할 수 없습니다. 시료 안의 형광 단백질은 독특한 방출 색을 만들어냅니다. GFP와 같은 이러한 형광 단백질들은 주로 해양 생물로부터 얻어집니다.

그림 1: Microspheres의 형광 이미지

세부 기술 사항

일반적으로 fluorescence microscope의 기술적 세부 사항은 전 종류의 표준 brightfield illumination microscope 또는 darkfield illumination microscope를 잘 설명해줍니다. 복잡한 필터링 기술로부터 비롯되는 신기술은 좁은 대역의 빛을 선별하고 활용하는 데 사용됩니다. 정밀한 fluorescence microscope에 필요한 세 가지의 중요한 필터는 excitation, dichroic, 그리고 emission 필터입니다. 더 자세한 정보를 보시려면, Fluorescence Microscopy에서의 형광단과 필터를 참고하십시오.

1. Excitation Filter: fluorescence microscope의 빛의 경로 안에 위치합니다. 이것은 검사 중인 fluorophore 또는 시료의 방출 범위를 제외한 광원의 모든 파장을 걸러줍니다.
2. Dichroic Filter: excitation filter와 emission filter 사이에 45° 각도로 위치합니다. 이것은 여기 신호를 검사 중인 fluorophore를 향해 반사시켜주며, 방출 신호를 detector를 향해 투과시켜줍니다.
3. Emission Filter: fluorescence microscope의 이미지 경로 안에 위치합니다. 이것은 검사 중인 flurophore의 모든 여기 영역을 걸러주며, fluorophore의 방출 신호을 투과시켜줍니다.

그림 2: Fluorescence Microscopy에 대한 기본적인 광학 필터 배열

이 외에 광학 현미경 용도로는 brightfield illumination, darkfield illumination, phase contrast, 그리고 differential interference contrast가 있습니다.