Fluorescence Microscopy를 위한 Fluorophores 및 Optical Filters

Fluorophore(또는 fluorochrome)는 fluorescent dye의 일종으로서 fluorescence microscopy에 의한 검사를 위해 proteins, tissues 및 cells에 형광 레이블을 표시하는 데 사용합니다. fluorophore는 흔히 Excitation Range라 부르는 특정 파장 범위의 에너지 흡수에 의해 작동되며 해당 에너지를 흔히 Emission Range라 부르는 다른 특정 파장 범위의 에너지로 재방출합니다.

A Generalized Fluorophore Spectral Curve

그림 1: 보편적인 fluorophore 스펙트럼 곡선

일반적으로, fluorophore는 high frequency illumination(ultraviolet, violet 또는 스펙트럼의 청색 범위 파장)에 의해 흥분되며(에너지 흡수), 약간 낮은 주파수(녹색, 적색 또는 스펙트럼의 NIR 범위 파장)로 에너지를 방출합니다. 각 fluorophore는 가장 효율적으로 에너지를 흡수하는 파장이 있는데 이를 당사의 interactive filter table에서는 Peak Excitation λ (nm)로 표현하고, 흡수된 에너지를 최대한 재방출하는 파장을 interactive filter table에서 Peak Emission λ (nm)라 부릅니다. 이들 각각의 파장에서 최대의 투과량을 갖는 개별 광학 필터를 선택하면 밝은 형광 이미지가 보장됩니다.

Fluorescence microscopy 용도에서 사용되는 일반적인 fluorescence microscope 설치는 3개의 필터로 구성됩니다. 일반적인 설치는 그림 2를 참조하십시오.

필터 #1: EXCITATION FILTER

Excitation filter는 fluorescence microscope의 illumination path에 위치합니다. 목적은 검사 대상 fluorophore의 excitation range를 제외한 광원의 모든 파장을 걸러내는 것입니다. 필터의 Minimum Transmission %는 이미지의 밝기와 휘도를 나타냅니다. Edmund Optics는 모든 excitation filter에 대해 최소 40% 이상의 투과율을 권장하며 이상적인 투과율은 85% 이상입니다. excitation filter의 대역폭은 fluorophore의 excitation range 이내여야 하며 이상적인 필터는 Center Wavelength (CWL)가 문제의 fluorophore가 갖는 peak excitation 파장에 가능한 한 가까워야 합니다. excitation filter의 Optical Density(OD)는 배경 이미지의 darkness를 나타내는데 이는 optical density가 필터가 대역폭 밖의 파장을 얼마나 잘 차단하는가에 대한 측정치이기 때문입니다. Edmund Optics는 3.0의 최소 optical density를 권장하며 이상적인 optical density는 6.0입니다. Center Wavelength, Minimum Transmission %, 그리고 Optical Density가 이상적으로 조합된 광학 필터는 가장 깊은 차단 성능으로 가능한 한 가장 밝은 이미지를 제공해 가장 흐린 방출 신호도 감지할 수 있습니다.

그림 2: 일반적인 fluorescence microscope 설치

필터 #2: EMISSION FILTER

Emission filter는 fluorescence microscope의 imaging path에 위치합니다. 목적은 검사 대상 fluorophore의 전체 excitation range를 걸러내어 해당 fluorophore의 방출 범위를 투과시키는 것입니다. Emission Filters에 대해서도 Excitation Filters용 Minimum Transmission, 대역폭, Optical Density, 그리고 Center Wavelength 권장 사항이 그대로 적용됩니다. 한 번 더 말하지만, Center Wavelength, Minimum Transmission %, 그리고 Optical Density가 이상적으로 조합된 emission filter는 가장 깊은 차단 성능으로 가능한 한 가장 밝은 이미지를 제공해 가장 흐린 방출 신호도 감지할 수 있습니다.

필터 #3: DICHROIC FILTER 또는 BEAMSPLITTER

Dichroic filter 또는 beamsplitter는 excitation filter와 emission filter 사이에 45° 각도로 배치됩니다. 목적은 excitation signal을 검사 대상 fluorophore쪽으로 반사해 emission signal을 detector쪽으로 투과시키는 것입니다. 이상적인 dichroic filter 또는 beamsplitter는 excitation filter의 대역폭에 대해서는 95% 이상의 반사율, 그리고 emission filter의 대역폭에 대해서는 90% 이상의 투과율로 최대 반사율과 최대 투과율 사이에 날카로운 transition을 갖습니다. 필터를 고를 때는 fluorophore의 Intersection Wavelength (λ)를 감안해 형광 이미지에서 최소한의 stray-light와 최대한의 signal-to-noise ratio를 보장해야 합니다. 적절한 dichroic filter 또는 beamsplitter 선택이 까다로운 일이긴 하지만 Edmund Optics는 고객의 용도에 적합한 optical filter 선택을 도와 드릴 수 있습니다. 요구 사항에 대해 상담하려면 당사로 연락해 주시기 바랍니다.

EO는 적합한 필터를 어떤 방법으로 찾아냅니까?

Edmund Optics는 지정된 fluorophores 각각의 excitation 또는 emission region 이내에 들어 오는 광학 필터를 수십 종씩 보유하고 있고 배송 준비가 되어 있습니다. fluorophore를 기준으로 필터를 신속하면서 쉽게 검색할 수 있습니다. peak excitation 또는 emission wavelength와 가장 근접해 있고 해당 파장에서 최대 투과율을 갖고 있는 권장 필터를 찾기만 하면 됩니다. 여러 가지 fluorophores, laser sources, 대체 dichroic filters 또는 beamsplitters를 사용하는 fluorescence microscopy 용도 또는 일반적인 fluorescence microscope 설치에 비해 더 복잡한 용도의 경우, 사양에 대해 상담하려면 당사로 연락해 주시기 바랍니다.