레이저 조명을 이용한 형광 이미징

일반적인 형광 이미징이나 현미경 시스템은 주로 3가지 부품(illumination source, photo-activated fluorophore sample, detector)으로 구성됩니다. 샘플의 excitation band 내에서 샘플로 입사하는 빛은 형광단(fluorophore)으로 하여금 빛을 방출하도록 하게 할 것입니다. 대개 샘플은 excitation band 내에서는 광자를 흡수하고 emission band에서는 더 낮은 에너지와 더 긴 파장으로 광자를 방출합니다. Two-photon fluorescence (2광자 형광)는 다른 류의 흔한 형광 메커니즘으로서 excitation band보다 2배 더 긴 파장에서 광자로 인해 형광단이 여기 상태일 때 발생할 수 있습니다. 형광은 이와 같은 방식으로 일어나며, 이는 2배 더 긴 파장 영역으로부터 광자가 해당 에너지의 절반만을 가지고 있기 때문에 반드시 2광자가 형광 빛을 방출할 때 필요한 최소 에너지에 도달해야만 합니다.

시스템 성능의 향상을 위해서는 2개의 필터를 사용할 수 있습니다. 하나는 광원과 견본 사이에 위치하는 필터이고, 다른 하나는 샘플과 디텍터 사이에 위치하는 필터입니다. 필터링의 취지는 모든 빛의 범위를 excitation 혹은 emission band 내로 한정시키는 데 있습니다. 레이저와 같이 오로지 excitation band 이내에만 위치하는 협폭의 조명 광원을 사용하면 시스템의 성능이 훨씬 더 증진되어 excitation filter의 필요성을 제거할 수 있습니다.

아래의 그래프들은 많이 애용되는 형광에 관한 예제로서 고성능 형광 이미징 또는 현미경 시스템 내에 사용할 수 있는 illumination laser와 emission filter의 적절한 조합을 보여줍니다. 2 종류의 파란색 곡선은 형광의 excitation과 emission band를 나타내며, 녹색 곡선은 emission band로부터의 최고 투과율을 적절히 분리해주는 필터의 투과 프로파일을 나타냅니다.