Fluorescence Microscopy: Imaging Filters가 장착된 In-Line Illumination

저자: Stephan Briggs

기본 설치 | 추천 부품

카메라 기술의 발전은 생물학 및 산업 용도에서 microscopy에 혁신을 가져왔습니다. 생물학자나 엔지니어들은 더 이상 계속 초점을 조절하면서 여러 시간 동안 지루하게 접안 렌즈를 들여다 보고 있지 않아도 됩니다. 오늘날, 데이터 기록 및 분석의 단순화는 Digital video microscope 시스템을 통해 이루어지고 있습니다. 이런 유형의 시스템에 대한 일반적인 정보를 원하면 Digital Video Microscope Objective 설치를 참조하십시오.

Digital video microscope 시스템의 장점을 실제로 보려면 최적의 contrast 및 emission quantification을 위한 필터링과 in-line illumination을 활용하는 구성을 고려해 보십시오.

FLUORESCENCE MICROSCOPY 기본 지식

Fluorescence microscopy는 빛의 다양한 파장에 대한 absorption 및 excitation을 측정 및 분석하는 데 아주 적합합니다. in-line fluorescence microscopy 설치에서는 illuminator에서 Parallel Optical Path로 빛의 방향을 바꾸기 위해 plate beamsplitter를 활용합니다. 기계적으로, 이 설치는 일부 다른 digital video microscope 시스템에 비해 덜 복잡하며 그림 1과 매우 비슷합니다. 대부분의 광학 시스템처럼 이 시스템은 센서, 광학 부품, 그리고 검사 대상 피사체로 시작됩니다. 본 설명을 위해 #59-877 10X EO M Plan Apo Infinity Corrected Objective 및 광학 부품용 #54-774 MT-1 액세서리 Tube Lens에 추가로 #59-367 EO-3112C ½" CMOS Color USB Camera를 센서용으로 사용합니다. #54-774는 infinity corrected objective로부터 이미지를 형성하는 데 필요한 액세서리 렌즈의 한 종류입니다. 검사 대상 피사체에는 검사 및 타겟용으로 생물학적 표본, 식물 또는 곤충, 유리 또는 금속 소재가 포함될 수 있습니다.

그림 1: 7개 부품으로 구성된 Fluorescence Microscopy용 Infinity Corrected Digital Video Microscope 시스템

그림 1의 digital video microscope 시스템에서 excitation 및 emission 파장을 선택할 때 광학 필터 선택이 중요합니다. 광학 필터 추가를 통해 이 설치 유형은 fluorescence microscope(그림 2)로 불리는 경우가 많으며 이것은 confocal, multiphoton, 그리고 Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy와 같은 고급 기술의 뼈대 역할을 합니다. 광학 필터의 종류에 대한 자세한 내용을 보려면 Fluorescence Microscopy를 위한 Fluorophores 및 Optical Filters를 참조하십시오.

특정 파장을 차단하면 표본에 과도한 광량으로 충격을 줄 수 있습니다. 특히, fluorescence microscope 아래에서 표본을 촬영할 경우 정량화할 수 있는 광량을 방출하기 위해 상당한 양의 excitation 에너지가 필요합니다. 높은 optical densities의 Hard-coated filters 및 dichroic filters는 특정 파장을 빠르고 쉽게 차단합니다. dichroic 및 emission filters는 시스템에서 가장 중요한 필터 두 개입니다. dichroic filter는 fluorophores를 들뜨게 하는 보다 짧은 파장을 반사하고, 방출되는 더 긴 파장을 투과시킵니다. 이 광학 필터들은 함께 비 방출 에너지와 stray light가 센서에 닿지 않게 합니다. 필터의 주요 매개변수에는 center wavelength (CWL), minimum transmission percentage, optical density (OD), 그리고 bandwidth가 포함되며 bandwidth는 가끔 FWHM(full width at half maximum)이라고도 부를 수 있습니다. 필터에 대한 보다 자세한 내용을 보려면 광학 필터를 참조하십시오.

그림 2: Fluorescence Microscopy용 기본 Optical Filtering Arrangement

광학 및 기계 부품

정교한 fluorescence microscopy 설치를 위해서는 다양한 광학, 이미징 및 positioning 부품이 필요합니다. 선택 과정을 가능한 한 쉽게 만들기 위해 표 1에는 추천 제품, 재고 번호 및 수량이 자세히 기재된 전체 부품 목록(자재 명세서)이 포함되어 있습니다.

그림 3에서는 표 1의 제품들을 사용한 실제 설치 사례를 설명합니다. 위에서 아래로, #59-367 EO-3112C ½" CMOS Color USB Camera부터 조립이 시작되어 #54-774 MT-1 액세서리 Tube Lens와 연결되는 #58-329 및 #55-743 C-mount adapters로 계속됩니다. tube lens 뒤부터 objective 이전까지의 공간은 Parallel Optical Path이며 이는 infinity corrected 시스템의 장점입니다. 이 optical path는 distortion 또는 aberrations이 없는 광학 부품을 만들 수 있게 합니다. 그림 3에서 #56-658 6 Position Filter Wheel Assembly는 여러 가지 bandpass emission filters, 그리고 in-line illumination을 위한 백색광을 아래쪽으로 반사하고 objective를 통과해 센서로 투과되는 원치 않는 빛을 제거하는 dichroic beamsplitter를 고정합니다. 마지막으로, #59-877 10X EO M Plan Apo Infinity Corrected Objective는 일련의 기계 부품과 함께 표본을 최상의 초점 위치로 이동시킵니다. 그림 4에서는 filter wheel assembly 및 tube lens 뒤의 배치 상태를 가까이에서 보여 줍니다.

그림 3: Fluorescence Microscope 설치 샘플

그림 4: Filter Wheel Assembly 및 Parallel Optical Path에서의 Bandpass Filters 클로즈업

Digital video microscope objective 설치는 공업 및 생물학 샘플을 검사하기 위한 강력한 광학용 툴입니다. 사용자가 원하는 수준에 따라 4개 부품으로 구성된 시스템부터 12개 이상의 부품으로 구성된 시스템까지 단순할 수도, 복잡할 수도 있습니다. 12개 이상의 부품을 사용하는 시스템은 대개 복잡한 필터링 방식과 광학 경로에 광학 필터를 배치하는 데 필요한 기술을 갖고 있습니다. 카메라-대물렌즈 시스템의 광학 경로 내에 광학 부품을 포함시켜야 할 때는 7개 부품으로 구성된 infinity corrected 시스템이 아주 적합하며 특히, fluorescence microscopy 용도로는 더욱 그러합니다.