Microscope와 Objective 이해

Microscope 구성 요소 | 핵심 개념 및 규격 | Optical Microscopy 응용 사례

Microscope는 사람의 눈 또는 비디오 장치에 피사체의 상을 맺게 하기 위해 사용되는 광학 기기입니다. 두 가지 부품으로 구성된 초기의 microscope는 관찰 대상 피사체의 이미지를 사람의 눈이 관찰할 수 있는 것보다 더 크게 보여 주는 수준에 지나지 않았습니다. 이제는 microscope의 디자인이 진화해 여러 개의 lens, filter, polarizer, beamsplitters, sensor, 광원, 그리고 그 밖의 많은 구성 요소까지 내장됩니다. 이러한 복잡한 광학 기기를 이해하기 위해 microscope의 구성 요소, 핵심 개념 및 규격, 그리고 응용 사례를 고찰해 보시기 바랍니다.

Microscope의 구성 요소

Compound microscope는 여러 개의 lens 부품이 포함된 현미경입니다. 하나의 lens를 사용해 눈으로 자세한 부분을 구분할 수 있도록 작은 물체를 확대하는 단순한 확대경과 비슷하게 작동합니다. 단순 확대경에서 피사체는 단일 lens의 focal length 안에 배치됩니다. 이렇게 해 확대된 가상 이미지가 생성됩니다. Microscope에서 relay lens system은 single lens를 대체합니다. Objective와 eyepiece가 연동되어 피사체 이미지를 용도에 따라 눈 또는 sensor에 투사합니다. Microscope에서 전체 시스템 배율을 높여 주는 부분은 objective와 eyepiece의 두 가지가 있습니다. 피사체에 가장 가까이 있는 objective는 피사체의 실제 이미지를 eyepiece에 전달합니다. Microscope의 이 부분은 기본적인 확대 기능에 필요합니다. 눈이나 sensor에 가장 가까이 있는 eyepiece는 이 실제 이미지를 투사 및 확대하고 피사체의 가상 이미지를 생성합니다. Eyepiece는 대개 추가로 10X 배율을 구현하지만 배율은 1X부터 30X까지 다양할 수 있습니다. 그림 1에서는 compound microscope의 구성 요소를 보여 줍니다. 추가로, 공식 1에서는 전체 시스템 배율을 계산하는 방법을 보여 줍니다.

그림 1: compound microscope 구성 요소

Eyepiece

Microscope가 처음 발명되었을 때 eyepiece는 관찰 대상 피사체를 실제로 볼 수 있는 유일한 수단으로서 설계에서 중요한 역할을 차지했습니다. 오늘날엔 모니터나 스크린에 피사체의 이미지를 투사하는 데 아날로그 또는 디지털 카메라가 사용됩니다. Single element 디자인에 비해 더 넓은 field of view를 만드는 여러 가지 디자인이 존재하지만 Microscope eyepiece는 보통 field lens와 eye lens로 구성됩니다. 올바른 디자인 선택에 대한 간단한 지침은 "올바른 Eyepiece 선택"을 참조하십시오.

조명

Microscope 안의 Illumination은 적절한 eyepiece나 objective를 선택하는 것만큼이나 중요합니다. 올바른 illumination을 선택하는 것은 가장 확실한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. Illumination 장치 유형을 결정하기 전에 용도 설정, 검사 대상 피사체, 그리고 원하는 결과를 검토하십시오.

많은 microscope에서 검사 대상 피사체를 지나치게 밝게 비추는 기존의 direct light illumination 대신 backlight illumination을 사용합니다. Microscopy 용도로 사용되는 특별한 유형의 backlight illumination이 Koehler illumination입니다. Koehler illumination에서 전구와 같은 광원의 입사광은 검사 대상 피사체를 뒤쪽에서부터 비춥니다(그림 2). Koehler illumination에는 convex lens 2개(collector lens와 condenser lens)가 사용됩니다. 이 디자인은 objective에서 생성된 이미지가 eyepiece를 통해 재현되는 image plane과 object plane에 밝고 고른 조명을 제공하도록 고안되었습니다. 이것은 사용자가 전구의 필라멘트를 이미징하지 않도록 보장하기 때문에 중요합니다. Backlight illumination은 피사체를 뒷면에서 비추기 때문에 brightfield illumination으로도 불립니다.

그림 2: Koehler Illumination 장치

Brightfield illumination에는 피사체 전반의 opacity 변화가 필요합니다. 이러한 변화가 없으면 illumination으로 인해 피사체 주변에 dark blur가 생성됩니다. 이로 인해 피사체 일부와 광원 사이의 relative contrast 이미지가 생깁니다. 대부분의 경우에 피사체가 극히 투명한 경우가 아니면 최종 이미지를 통해 사용자는 피사체의 각 부분을 선명하게 볼 수 있습니다. 피사체가 너무 투명해 brightfield illumination을 사용해 특징을 구분하기 힘들 때는 darkfield illumination을 사용할 수 있습니다.

Darkfield illumination에서 빛은 objective에 직접 전달되는 대신 피사체에 비스듬한 각도로 부딪힙니다. 이 광선은 여전히 object plane의 피사체를 비춘다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 결과로 인한 darkfield illumination 이미지는 투명한 피사체와 광원 사이에 high contrast를 구현합니다. Microscopy 장치에 사용할 때 darkfield illumination은 중심부의 광선을 차단하면서도 피사체에 비스듬한 빛을 비추는 inverted cone of light를 형성하는 광원을 구현합니다. 그림 3에서는 속이 빈 cone of light가 objective의 numerical aperture인 darkfield illumination 장치의 예를 보여 줍니다. 비교해 보면 brightfield illumination 장치에서는 차단되는 광선이 없습니다. darkfield illumination의 디자인은 빛이 조사 대상 피사체를 비추면서도 optical system에는 들어가지 않도록 해 투명한 피사체용으로 아주 적합합니다.

그림 3: Darkfield Illumination 장치

Microscopy 용도로 사용되는 세 번째 illumination 유형은 epi-Illumination입니다. Epi-illumination은 피사체 위에 빛을 조사합니다. 결과적으로 objective 및 epi-illumination source가 Koehler illumination 장치를 대신합니다. 결과적으로 objective 및 epi-illumination source가 Koehler illumination 설치를 대신합니다. 그림 4에서는 일반적인 fluorescence 용으로 자주 사용되는 epi-illumination 장치를 보여 줍니다. Fluorescence Microscopy에 대한 자세한 내용을 보려면 "Fluorescence Microscopy를 위한 Fluorophores 및 Optical Filters"를 참조하십시오.

그림 4: Epi-Illumination 장치

Objectives

Objective는 microscope가 확대된 실제 이미지를 제공할 수 있게 하며 여러 가지 요소로 설계되어 있어 microscope 시스템에서 가장 복잡한 구성 요소에 속합니다. Objective의 배율 범위는 2X – 200X입니다. 이 구성 요소는 전통적인 refractive 타입과 reflective 타입의 두 가지로 분류됩니다. 종류별로 다시 finite conjugate와 infinite conjugate(infinity corrected)로 세분됩니다. 올바른 Objective를 선택하기 위해서는 종류 및 유형별 장점을 아는 것이 중요합니다.

Objectives: Refractive

Objective 중에서 가장 널리 사용되는 종류는 refractive입니다. Refractive 디자인에서는 광학 소자에 의해 시스템을 통과하는 빛이 굴절되거나 구부러집니다. 각각의 광학 소자는 대개 AR 코팅 처리되어 있어 back reflections을 줄이고 전체 light throughput을 향상시킵니다. Refractive objective는 아주 높은 resolution이 필요한 machine vision 용도에 자주 사용됩니다. 서로 다른 광학 구성을 활용하는 여러 가지 refractive objective 디자인이 존재합니다. 기본적인 achromatic objective 2개 element(achromatic lens와 meniscus lens)부터 plan-apochromatic objective 15개 element까지 다양한 디자인이 가능합니다(그림 5). Plan-apochromatic objective는 가장 복잡하고 objective 자체 내에서 chromatic 및 flat field correction이 이루어지는 하이엔드 objective 디자인입니다.

그림 5: Apochromatic (좌) 대 Achromatic (우) Objective 디자인

Objectives: Reflective

Reflective objective는 reflective 또는 mirror를 기반으로 한 디자인을 사용합니다. 이 디자인은 refractive 디자인에 비해 저평가되는 경향이 있지만 후자에 존재하는 많은 문제점을 보정할 수 있습니다. Reflective objective는 검사 대상 피사체 이미지를 확대하고 전달하는 primary 및 secondary mirror 시스템(그림 6)으로 구성됩니다. 다른 디자인을 사용할 수도 있지만 Edmund Optics®는 유명한 Schwarzschild 디자인을 활용합니다. 빛은 금속 표면에는 반사되고 유리 표면에서는 굴절을 일으키기 때문에 reflective objective에서는 refractive objective와 같은 aberration이 발생하지 않아 이러한 aberration 보정에 따른 추가 디자인이 필요하지 않습니다. 시스템이 기본적으로 사용 중인 glass substrate 대신 mirror coating에 의존하기 때문에 Reflective objective는 fine detail imaging을 위한 우수한 resolving power뿐 아니라 더 높은 light efficiency를 구현할 수 있습니다. Reflective objective의 또 다른 장점은 상용 refractive optics에 비해 mirror를 사용함으로써 ultra-violet (UV) 또는 infrared (IR) 스펙트럼 영역을 자세히 관찰할 수 있는 가능성을 갖고 있다는 점입니다.

그림 6: Reflective Objective의 구조

핵심 개념 및 규격

Objective 디자인/표준, magnification, numerical aperture, working distance, lens to image distance, 그리고 cover slip thickness correction 등의 대부분의 microscope objective 규격은 objective 본체에 기록되어 있습니다. 그림 7에서는 microscope objective 규격을 읽는 방법을 보여 줍니다. 규격은 objective 본체에 직접 기록되어 있기 때문에 어떤 규격의 objective를 갖고 있는지 정확히 파악하기가 쉽고 이는 여러 개의 Objective를 용도에 맞춰 결합할 때 매우 중요한 점입니다. Focal length, field of view, 그리고 design wavelength와 같은 여타 규격들은 공급업체 또는 제조업체가 제공하는 규격을 이용해 쉽게 계산하거나 찾을 수 있습니다.

그림 7: 일반적인 Transmissive Microscope Objective

Objective의 표준

Objective가 DIN 또는 JIS와 같은 단순한 microscope 표준을 따르는 경우 시스템에 어떤 규격이 필요한지 보여 주는 규격이 본체에 기록되어 있습니다. 대부분의 compound microscope에는 Deutsche Industrie Norm, 또는 DIN 표준이 사용됩니다. DIN 표준에서 objective flange로부터 eyepiece flange까지의 거리는 160mm입니다(그림 8). 그 밖에 사용 가능한 표준은 Japanese Industrial Standard 또는 JIS입니다. JIS 표준에서 objective flange로부터 eyepiece flange까지의 거리는 170mm입니다(그림 9). Objective로부터 투사된 이미지가 eyepiece를 통해 올바로 맺히도록 하기 위해서는 Objective와 eyepiece를 선택할 때 이 두 가지 거리에 주의해야 합니다. DIN과 JIS에서의 이미지 거리에 차이가 있긴 하지만, 광학 성능에는 아무런 차이가 없으며 품질 면에서는 동일합니다. 이와 마찬가지로, 각각의 표준은 0.7965" x 36TPI의 동일한 RMS mounting thread를 이용합니다.

DIN과 JIS는 고전적인 compound microscope를 고려할 때 사용해 왔습니다. 일부 microscope 제조업체는 기계적 특성 대신 광학 특성으로 tube lens 길이를 기록하는 쪽을 선호합니다. DIN 표준 objective의 경우, eyepiece가 중간에 위치한 image plane을 이미징 처리하기 때문에 이로 인해 tube lens 길이가 150mm까지 변화됩니다(그림 8). 마지막으로, 사용자가 어떤 길이인지 알수 있게 해 주는 objective용으로 기록되는 규격이 하나 더 있는데 parfocal distance(PD)가 그것입니다. Parfocal distance는 objective flange로부터 관찰 대상 피사체까지의 거리입니다. DIN objective의 경우 이 거리는 표준 45mm이고 JIS의 경우 36mm입니다(그림 8과 9).

그림 8: DIN 표준d

그림 9: JIS 표준

배율

Eyepiece와 objective는 모두 전체 시스템 배율에 기여하는 배율을 갖고 있습니다. 배율은 보통 숫자 값 뒤에 X를 붙여 표시합니다. 대부분의 objective에는 이미지 배율을 나타내는 컬러 밴드가 전체 둘레를 감싸고 있습니다(그림 7). 예를 들어, 노란 색 밴드는 10X 배율을 나타냅니다.

Numerical Aperture

Objective의 Numerical Aperture(NA)는 focal length와 entrance pupil diameter의 함수입니다. NA가 큰 objective에는 관찰 대상 피사체와 objective 앞쪽 사이에 immersion oil을 사용해야 할 경우도 있습니다. 이는 공기 중에서 확보할 수 있는 최대 NA가 1(90° 입사각)이기 때문입니다. 각도를 키우고 objective를 통과하는 빛의 양을 늘리려면(공식 2) immersion oil(일반적인 굴절률 = 1.5)을 사용해 피사체와 objective 사이의 굴절률을 변화시켜야 합니다. NA가 큰 objective를 immersion oil과 함께 사용하는 것은 비용이 많이 드는 방식인 objective 교체를 간단히 대체할 수 있는 수단입니다.

Field of View

Field of View는 microscope 시스템에 의해 이미지가 형성되는 피사체의 영역입니다. Field of View 크기는 objective 배율에 의해 결정됩니다. Eyepiece-objective 시스템을 사용할 때 objective로부터의 Field of View는 관찰을 위한 eyepiece에 의해 확대됩니다. 카메라-objective 시스템에서 이 field of view는 카메라 센서에 연계됩니다. 카메라의 sensor는 사각형이며 objective의 완전한 원형 field of view의 일부에 대한 이미지만 포착할 수 있습니다. 이와 대조적으로, 눈의 망막은 둥근 영역의 이미지를 처리하고 전체 field of view를 포착할 수 있습니다. 이것이 바로 camera-microscope 시스템에 의해 생성된 Field of View가 대개 eyepiece-microscope 시스템에 의해 생성된 Field of View에 비해 살짝 작은 이유입니다. 공식 3과 4를 사용해 앞서 언급한 시스템에서의 field of view를 계산할 수 있습니다.

Cover Slip 두께

박테리아, 세포 배양액, 혈액과 같은 액체를 관찰할 때는 검사 대상 피사체와 microscope 부품을 오염으로부터 보호하기 위해 cover slip을 사용할 필요가 있습니다. Cover slip 또는 glass microscope slide는 피사체의 빛이 objective로 굴절되는 길을 바꿉니다. 결과적으로, objective는 최상의 이미지를 생성하기 위해 적절한 광학적 보정을 해야 합니다. 이것이 바로 objective가 최적화된 cover slip 두께 범위를 명기하는 이유입니다. 일반적으로 이 값은 무한 기호(objective가 infinite conjugate 또는 infinity corrected 디자인임을 나타냄) 뒤에 표시되며 0(cover slip 보정 안함)부터 0.17mm까지의 범위를 갖습니다.

품질 보정

Objective와 eyepiece의 품질은 시스템 성능을 결정합니다. 사용할 objective의 종류를 결정할 때 디자인의 배율과 복잡성을 선택하는 것에 더해 올바른 품질 보정에 대한 이해가 매우 중요합니다. 품질 보정(즉, achromatic, apochromatic, plan, semi-plan)은 objective 자체에 명시되어 사용자가 쉽게 문제의 objective 디자인을 볼 수 있게 해 줍니다. 일반적으로 chromatic aberration 보정에는 achromatic과 apochromatic의 2단계 보정이 적용됩니다. Achromatic objective는 가장 단순하고 비용이 적은 objective에 속합니다. 이 objective는 적색 및 청색 파장에서의 chromatic aberration 보정, 그리고 녹색 파장에서의 spherical aberration 보정을 위해 디자인되었습니다. Chromatic aberration의 보정 제한 및 flat field of view 부족은 objective 성능을 저하시킵니다. Apochromatic objective는 이와 대조적으로 높은 정밀도를 제공하며 적색, 청색, 그리고 황색에 대해 색수차가 보정됩니다. 또한 2~3개 파장에 대한 spherical aberration 보정 기능을 제공하고 일반적으로 높은 numerical aperture (NA)와 긴 working distance를 갖고 있습니다. Apochromatic objective는 white light 용도에 아주 적합한 반면 achromatic objective는 monochromatic에 최적입니다. 하지만 두 가지 objective 디자인 모두 distortion과 field curvature 문제가 심각하며 이 문제는 objective 배율이 증가하면 더욱 악화됩니다. 따라서 objective 성능만 생각할 것이 아니라 전체 시스템 성능에 초점을 맞추는 것이 중요합니다.

Planar로도 알려진 Plan, semi-plan, semi-planar 또는 microplan objective는 field curvature가 보정됩니다. Field curvature는 flat image plane에서 초점을 맞추기 위해 off-axis image를 가져올 수 없을 때 존재하는 aberration의 한 종류로서 optical axis에서 벗어남에 따라 이미지가 흐려집니다. 그림 10에서는 achromatic, semi-plan, 그리고 plan objective 디자인에서 중심부로부터 방사상으로 측정된 field flatness를 보여 줍니다. Achromatic objective는 이미지 중심 65%에서 flat field를 갖습니다. Plan objective는 전반적으로 가장 정확하며 90%의 field가 평평하게 보이고 초점이 맞습니다. Semi-plan objective는 다른 두 가지 유형의 중간으로서 field의 80%가 평평하게 보입니다.

그림 10: Flat Field 보정: Achromatic 65% (좌) 대 Semiplan 80% (가운데) 대 Plan 90% (우)

Finite Conjugate

Finite conjugate 광학 디자인에서 광원에서 나온 빛(infinity의 빛이 아님)은 한 점에 모아집니다(그림 11). Microscope의 경우 관찰 대상 피사체 이미지는 확대된 뒤 eyepiece에 투사되거나 카메라를 사용할 경우 sensor에 투사됩니다. 시스템 내에서의 특정 거리는 DIN 또는 JIS 표준별로 특징지어집니다. 모든 finite conjugate microscope는 이들 두 가지 표준 중 하나에 속합니다. 이런 종류의 objective가 기본적인 microscope의 대다수에 사용됩니다. Finite conjugate 디자인은 비용, 그리고 사용 편의성이 중요시되는 용도에 사용됩니다.

그림 11: 단순화된 Finite Conjugate Microscope 디자인

Infinite Conjugate (Infinity Corrected)

Infinite conjugate 또는 infinity corrected 광학 디자인에서, infinity에 배치된 광원에서 나온 빛은 작은 점으로 모아집니다(그림 11). Objective에서 이 점은 관찰 대상 피사체이며 infinity는 eyepiece를 향하거나 카메라를 사용할 경우 sensor를 향합니다. 이런 종류의 현대적 디자인에서는 이미지를 생성하기 위해 피사체와 eyepiece 사이에 별도의 tube lens를 활용합니다. 이 디자인은 finite conjugate 디자인에 비해 훨씬 복잡하면서도 filter, polarizer, 그리고 beamsplitter와 같은 광학 구성 요소를 광학 경로에 넣을 수 있게 해 줍니다. 결과적으로 복잡한 시스템에서 추가 이미지 분석 및 외삽을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, objective와 tube lens 사이에 filter를 추가하면 특정 파장의 빛을 보거나 장치와 간섭을 일으킬 원치 않는 파장을 차단할 수 있습니다. Fluorescence microscopy 용도에서는 이런 유형의 디자인을 활용합니다. Infinite conjugate 디자인 사용의 또 다른 장점은 용도에 따라 배율을 변경할 수 있는 기능입니다. Objective 배율은 objective focal length에 대한 tube lens focal length의 비율(공식 5)이므로, tube lens focal length를 증감하면 objective 배율이 변경됩니다. 일반적으로, tube lens는 focal length가 200mm인 achromatic lens이지만 다른 focal length로 대체해 microscope 시스템의 전체 배율을 사용자 정의할 수도 있습니다. Objective가 infinite conjugate일 경우 objective 본체에 무한대 기호가 표시됩니다.

그림 12: 단순화된 Infinite Conjugate (Infinity Corrected) Microscope 디자인

OPTICAL MICROSCOPY 용도 예

Microscope의 구성 요소를 다양한 optical, imaging, 그리고 photonics 제품과 결합하는 방법을 이해하려면 fluorescence microscopy 및 laser ablation과 같은 optical microscopy를 검토해 보십시오. Microscope의 구성 요소들과 연결하기 위해 각각 고유의 설치 방식을 활용합니다.

Fluorescence Microscopy

Fluorophore(또는 fluorescent dye)는 검사 또는 연구를 위해 proteins, tissues 및 cells에 표시를 하는 데 사용됩니다. Fluorophore는 단일 파장의 빛을 흡수하고 다른 파장의 빛을 방출(fluoresce)할 수 있습니다. 전형적인 fluorescence microscopy 장치에서는 filter 3개(excitation filter, emission filter, 그리고 dichroic filter)를 사용합니다. 각 fluorophore에는 구체적인 absorption 또는 excitation 파장 대역이 있는데, excitation filter는 해당 대역의 파장만을 투과시킵니다. Fluorophore는 들뜬 상태가 되면 다양한 범위의 파장을 방출합니다. Emission filter는 방출 파장만 투과시킵니다. 방출 파장을 반사하고 excitation wavelength를 투과시키도록 특수 디자인된 dichroic filter는 excitation channel과 emission channel을 분리하는 데 사용됩니다. 그림 13에서는 일반적인 fluorescence imaging 장치에 대해 설명합니다. Fluorescence microscopy에 대한 자세한 내용을 보려면 "Fluorescence Microscopy를 위한 Fluorophores 및 Optical Filters"를 참조하십시오.

그림 13: 일반적인 Fluorescence Microscope 장치

Laser Ablation

Laser의 일반적인 용도 두 가지는 (1) base에 재료를 용접하거나 (2) base에서 재료를 제거하는 것입니다 정교한 beam 조작(즉, focusing, bending, scattering reduction)이 필요하기 때문에 Laser ablation 시스템에는 microscope 구성 요소가 필요합니다. Laser ablation 장치에는 보통 기성 부품 대신 맞춤형 광학 부품이 필요하며 정밀 디자인을 통해 laser가 시스템에 결합됩니다(그림 14). Laser는 epi-illumination 디자인에서 object plane에 빛을 모으고 aberration을 최소화하면서 아주 작은 spot size를 생성토록 하는 microscope objective의 기능을 활용하도록 배치됩니다. 또한 eyepiece를 통해 사용자는 laser의 위치를 파악하고 모든 기능이 정상 작동하는지 확인할 수 있습니다. Laser로 인한 눈 부상을 차단하려면 Filter가 필요합니다. Laser ablation 장치는 일반적인 외과수술 방식에 비해 높은 정밀도를 제공하기 때문에 의료 및 생물학용으로 사용됩니다.

그림 14: 일반적인 Laser Ablation 장치

Microscope와 objective는 많이 사용되는 복잡한 광학 시스템입니다. 이젠 더 이상 생물학용으로만 사용되지 않고(예: 기초 생물학 교실에서의 볼 세포 관찰) flourophore의 방출 파장 연구, 가공한 부품의 5μm 크기 결함 분석, base로부터의 재료 제거 검사, 그리고 optics, imaging, 그리고 photonics 산업의 수 많은 용도에 사용할 수 있습니다. Microscope의 구성 요소가 갖는 중요성과 규격에 대해 이해하고 있으면 최상의 시스템을 선택하고 최고의 결과를 얻어낼 수 있습니다.